Meghatározása glükóz-oxidáz módszert
Meghatározása a vér glükóz koncentrációja - az egyik leggyakrabban végzett biokémiai vizsgálatok laboratóriumokban.
A glükóz-oxidáz-módszerrel történő meghatározásának a glükóz a vérben és a vizeletben a glükóz-oxidációs reakciót az enzim jelenlétében a glükóz-oxidáz, hogy hidrogén-peroxidot képezve, amelyek viszont a peroxidáz jelenlétében oxidálódik ortotolidin a színes reakciótermékek; glükóz koncentráció ígéretet száma színes termékek.
Mivel a glükóz-oxidáz módszer célja, hogy azonosítani, pontosan a glükóz, nem minden típusú cukrok, hogy használják a differenciál diagnosztikájában a következő betegségek:
Az elv a meghatározására szolgáló eljárás a glükóz-oxidáz glükóz
Glükóz jelenlétében az enzim a glükóz-oxidáz oxidálja Xia légköri oxigén, hogy a reakció során keletkezik a hidrogén-peroxid. A hidrogén-peroxid jelenlétében peroxidáz enzim oxidálja ortotoluidin színezett formában kapcsolódni-TION, a szín intenzitása arányos-niju glükózt tartalmazó. Ez a módszer lehetővé teszi, hogy meghatározzuk a glükóz szintjének a vérplazmában, a szérum és a liquor.
- plazma natschesertse
- újszülött - 1,7-4,2
- gyermek 6 hetes és 15 év közötti - 3,3-5,4
- felnőttek (férfiak, nők) - 3,9-5,6
- szérum natschesertse
- újszülött - 2,6 - 4,2
- gyermekek 6 hetes és 2 éves - 3,3-5,4
- felnőttek (férfiak, nők) - 3,9-5,6
A szükséges reagensek a meghatározására glükóz glükóz-oxidáz
1. Nátrium-klorid 9 g / l (izotóniás oldat) úgy állítottuk elő, stretch-voryaya 0,9 g nátrium-klorid 100 ml vízben.
2. Cink-szulfát 50 g / l 5 g cink-szulfát (ZnSO4) oldatot-vízben oldjuk, a térfogatot 100 ml-re.
3. Nátrium-hidroxid, 0,3 mól / l: állítjuk elő, hogy 1,2 g nátrium-hidroxid 100 ml vízben, a koncentrációt ellenőrizni titrálással (meg kell 0,3 N).
4. Ortotoluidin 1% -os oldat: 1 g terméket feloldjuk 100 ml abszolút alkoholban. A megoldás lehet tárolni hűtőszekrények-nick egy üvegdugóval lezárt üvegben néhány hónapban. Kereskedelmileg-schiysya készítmény átkristályosítással tisztíthatjuk, amelyre azt abszolút etanolban oldjuk, vizet adunk hozzá, és a kicsapódott kristályokat szívatással szűrjük, majd szárítjuk kalcium-klorid felett.
5. acetát-pufferrel pH = 4,8: Mix 4 rész 0,25 n ecetsav (ellenőrizze titrálás) és 6 tömegrész 0,25 N nátrium-acetát (amely 34 g CH3COONa X ZN2O 1 liter).
6. Glükóz - száraz drog aktivitás 3000 U / mg vagy nagyobb.
7. torma-peroxidáz. 1 mg feloldunk 5 ml acetát pufferben, tárolható a hűtőben, mint egy nem-nappal.
8. Munkavégzés reagens: 80 ml acetát pufferben feloldunk 2 mg glükóz-oxidáz és 1 mg peroxidázt, hozzáadunk 1 ml 1% ortotoluidina oldatot, keverjük, és a térfogatot beállítjuk a pufferrel 100 ml-re. Working reagens átláthatónak kell lennie, színtelen vagy enyhén zöldes, ebben az esetben, akkor stabil, ha hűvös helyen tároljuk. Ha a szín intenzitását, vagy néhány óra főzés után Nachi-naet kicsapására, ami azt jelenti, hogy a ortotoluidin elegendő, de tiszta, és meg kell átkristályosítjuk.
9. Kalibrálás glükóz oldatok. Glükóz előzetes szárított, de hőmérsékleten 37 ° C-on, és exszikkátorban. Először is, egy törzsoldatot, amelynek koncentrációja 50 mmol / l-től 180 mg anyagot feloldunk 20 ml telített szol-Pa (körülbelül 0,3% -os) -benzoesav. Ebből az oldatból a működő kalibráló oldatokat úgy készítjük, amely 3; 6; 9; 12; 15; 18 és 21 mmol / l, amely úgy 0,6; 1,2; 1,8; 2.4; 3; 3,6 és 4,2 ml törzsoldatot állítjuk be telített oldatával benzoesav 10 ml térfogatra. Ezek az oldatok glükózt ugyanabban a koncentrációban, amelyben a vérben van, ami megkönnyíti a kalibrációs számításokat.
Progress in meghatározására glükóz-oxidáz módszert
A centrifugacsövet készült 1,1 ml nátrium-klorid-oldattal, 0,4 ml oldatban, a cink-szulfát és 0,4 ml 0,3 N NaOH-oldattal, keverjük; ahol a gél képződik nagyon vékony útmutató-rata cink-oxid, hogy megjelent 0,1 ml vért vagy manométer-TION oldatot ismét keverjük, és 10 perc után, centrifuga sebesség-ruyut 3000 rev. / perc 10 percig.
Ahhoz, hogy 1 ml felülúszót az oldathoz 3 ml dolgozik-rea tive és óvatosan keverjük.
Fokozatosan elszíneződés elkezd fejlődni, ami normál szobahőmérsékleten éri el a maximumot 13-15 percig, majd fokozatosan csökken a-gyűrődések. Fotometrikus mindig ugyanebben az időszakban az idő hozzáadása után a dolgozó egy küvettában, amelynek optikai út hossza 1 cm-es egy vörös szűrővel (hullámhossz 625 nm) egy olyan vakpróbával szemben, amely ad ez egyidejűleg a működési próbák, hanem a vér veszi fiziológiás nátrium-klorid-oldattal.
A készítmény a kalibrációs-FIC gra helyett vérmintát vesz 0,1 ml megfelelő kalibráló oldat.
Kiszámítása glükóz szintjének végezhetjük a szabály által arányban, vagy cal-rovochnomu ütemterve építése, amely az egyik tengelyen-none dyval glükózkoncentráció (mmol / l), és a másik - nagyságát jól kihalás.
Megjegyzések a meghatározásának módszere a glükóz-oxidáz módszert
1. Lehetőség van először, hogy kiadja a vért a pipetta-ég izotóniás nátrium-klorid-oldattal. majd az oldathoz szulfa, hogy a cink és a nátrium-hidroxid.
2. Amikor szisztematikus munka nem szükséges, hogy folyamatosan építeni egy kalibrációs görbe minden pontján, elegendő sün-fluoreszcens üres minta feldolgozásához és az 2-3 pont tartományban 3-9 mmol / l, és a teljes kalibrációs görbe felépíteni csak akkor, ha a változó reagensek vagy kovácsolás technikákat.